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碱基优化网站权威发布_2024强基线录取线(2024年12月精准访谈)

内容来源：丹顿SEO所属栏目：观点更新日期：2024-11-28

碱基优化网站

载体构建攻略𐟔犰Ÿ”젨𝽤𝓦ž„建全流程目的基因的扩增首先，从NCBI上找到目的基因的核苷酸序列，利用Snapgene设计引物。通常在序列的前后各选20-25bp作为上下游引物。先用普通MIX进行退火温度优化，然后使用高保真酶（如诺维赞的2X Phanta⮠Max Master Mix）进行50uL体系的扩增。若需要高浓度，可扩增两管。连接连接目的基因与载体可选择T4连接酶，需在目的基因两端设计酶切位点和保护碱基（注意这些位点不能出现在片段内，以免片段被内部切开）。也可选择无缝克隆方式，利用同源重组原理，在引物5'端加入载体的同源臂，引物顺序为同源臂+酶切位点+基因引物。我个人偏爱这种方式，省时方便。本次使用的是诺维赞的ClonExpress⮠II One Step Cloning Kit连接酶，9个片段一次性连接成功。20uL的连接体系在37℃作用30 min，取10 uL用于转化。目的基因与载体的比例本次使用的载体是PcDNA3.1(5500bp)，基本50ng的载体就足够了。ClonExpress⮠II One Step Cloning Kit试剂盒推荐的载体和片段的摩尔比为1：2，例如片段500bp，浓度5ng/uL，载体5000bp，浓度25ng/uL。则片段摩尔数是载体的2倍，片段需要2㗵=10ng，即2uL。转化取10 uL连接产物转化DH5a。阳性克隆的筛选在1.5mL的EP管中加入800 uL的氨苄LB，用10uL的枪头把单个菌落全部占走，打入EP管中，震荡培养4h。一般选择8个克隆。4h后进行菌液PCR鉴定阳性克隆，选择2个送测序。注意事项移码问题：选择酶切位点时注意是否会引起目的基因的移码，可用Snapgene模拟。感受态：购买的商品化感受态可一支当两用，否则太浓不好挑选。自制的感受态在使用前需设置阳性对照，排除感受态质量问题。终止密码子和起始密码子：用于蛋白表达的目的基因需从ATG开始，以终止密码子结尾。 𐟔砦ž„建小贴士退火温度优化：对于高保真酶，退火温度至关重要，可通过梯度PCR找到最佳温度。引物设计：选择合适的引物长度和位置，确保扩增效率和特异性。连接效率：优化连接体系，确保目的基因与载体的高效连接。筛选策略：通过多个克隆的筛选，提高阳性克隆的比例。通过以上步骤，你可以顺利构建出含有目的基因的载体，为后续实验打下坚实基础。

华南师范等优化CBE碱基编辑器，斑马鱼中实现建立人类疾病模型

𐟔젥𜕧‰騮𞨮᥅覔𛧕导š从基础到高级技巧引物是PCR反应的核心，其设计直接影响扩增的特异性和效率。以下是设计引物时需遵循的关键步骤和原则：选择保守区：𐟌 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。通过比较不同物种的同一基因，确定保守区，这有助于提高扩增的特异性。控制引物长度：𐟓 引物长度通常在15-30bp之间，理想长度为20bp。过长的引物可能导致延伸温度过高，不利于Taq DNA聚合酶的反应。优化G+C含量：𐟌€ G+C含量应保持在40-60%之间。G+C含量过低会影响扩增效果，而过高则可能导致非特异条带。ATGC应随机分布，避免连续的嘌呤或嘧啶核苷酸序列。调整Tm值：𐟌᯸ 引物的Tm值应在55-65℃之间，上下游引物的Tm值差异不应超过5℃。计算Tm值时，可以使用公式Tm=4（G+C）+2（A+T）。避免自身互补：𐟚력𜕧‰騇꨺뤸能有连续4个碱基的互补，以防止形成发夹状结构（Hairpin），这种结构会阻碍引物与模板的结合。防止引物间互补：𐟔„ 引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避免3’端的互补重叠，以防形成引物二聚体。修饰5’端：𐟌Ÿ 引物的5’端可以修饰，这通常不会影响扩增的特异性。修饰包括添加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等，甚至引入蛋白质结合DNA序列或突变序列。通过遵循这些原则，您可以设计出高效且特异性的PCR引物，为科研实验提供可靠的基础。

定点突变：科研中的小技巧与心得 𐟔在科研中，探究蛋白质功能的一个关键方法是定点突变。通过改变蛋白质中的一两个氨基酸残基，可以研究这种变化对蛋白质结构和功能的影响。 𐟔基因定点突变（site-directed mutagenesis）是一种定向改变蛋白质序列的方法。首先确定要改变的氨基酸残基位置，然后通过PCR技术定向修改基因序列，从而探讨蛋白质功能的变化。 ✍️以下是一些在进行定点突变时发现的问题和心得体会： 1️⃣ 试剂选择：很多研究者为了方便直接购买昂贵的试剂盒，其实可以选择同一品牌的散装试剂，如高保DNA聚合酶和游离碱基等。参考试剂盒的说明书，可以自行配制类似效果的体系。 2️⃣ 引物设计：设计引物时，尽量保持GC含量较低，但退火温度要适当高一些，建议在65℃左右。如果突变位点附近GC含量高，可以考虑使用GC rich buffer，可以有效提高突变成功率。 3️⃣ PCR体系优化：定点突变的关键在于引物设计和PCR体系的设置。延伸和后延伸的温度和时间非常重要。延伸时间根据使用的聚合酶质量来定，后延伸一般设置为10-15分钟。延伸温度选择68℃或72℃，退火温度尽量低于延伸温度1-2℃。 4️⃣ 琼脂糖电泳回收：是否需要将突变质粒进行琼脂糖电泳回收去杂，这并不是必要的步骤。残留的聚合酶和游离碱基等对转化BL21受体菌的影响不大，反而可能降低转化率。 5️⃣ DpnI酶消化：如果条件允许，可以使用DpnI酶消化模板质粒。经过多轮PCR反应后，模板质粒已经很少了，因此带来的假阳性可以忽略不计。后续可以通过双酶切和测序验证是否为阳性突变子。通过这些小技巧和心得体会，可以有效提高定点突变的成功率，为科研工作提供有力支持。

PCR引物设计指南：关键步骤详解 𐟓š 1. 𐟔 引物设计在保守区：选择模板cDNA的保守区设计引物，这是PCR成功的关键。通过在NCBI上搜索不同物种的同一基因，并使用序列分析软件（如DNAman）进行比对，找出基因的保守区。 𐟓 引物长度适中：引物长度通常在15~30碱基之间，推荐使用18-27bp，避免过长导致延伸温度过高，影响Taq DNA聚合酶的反应。 𐟌᯸ GC含量优化：引物的GC含量应在40%~60%之间，并确保上下游引物的GC含量相近。引物的Tm值（解链温度）应接近72℃，以提高复性条件。 𐟚렩🥅密码子第3位终止：如果扩增编码区域，引物的3′端不应终止于密码子的第3位，因为这可能会影响扩增的特异性和效率。 𐟏… 3′端选择T：引物3′端选择T比A更佳，因为T的错配效率较低，而A即使在错配时也能引发链的合成。 𐟌 碱基随机分布：引物序列在模板内应随机分布，避免3′端有连续的G或C，以减少错误引发的可能性。 𐟔„ 避免引物互补：引物自身及引物之间不应存在互补序列，以防止引物折叠成发夹结构或形成二聚体，影响PCR反应。 𐟔砨𐃦•𔢖𓇥€𜯼š如果引物二聚体和发夹结构不可避免，应尽量调整其△G值，使其小于4.5kcal/mol，以减少引物二聚体的产生。

酵母RNA提取与鉴定实验报告 𐟓… 实验日期：2024年1月22日 𐟌᯸ 天气：晴朗 𐟌᯸ 气温：20℃ 𐟓 实验预习报告 𐟔 掌握酵母RNA提取的方法 𐟓 了解RNA组分的鉴定原理 𐟔젥ꌥŽŸ理在酵母中，RNA与DNA的分离是提取RNA的关键步骤。通过使用特定的酶和化学试剂，可以将RNA从酵母中提取出来。RNA的鉴定则通过特定的化学反应来实现，如磷酸的检测、核糖的显色反应以及嘌呤碱基的检测。 𐟧ꠤ𛪥™褸Ž试剂 𐟧ꠤ𛪥™诼š试管、量筒、滴管、离心机、吸管、烧杯、水浴锅 𐟧꠨‰‚：硫酸洗液、苍黑的二乳化铁溶液、酵母培养液 𐟓 实验步骤 1️⃣ 酵母RNA的提取将酵母培养液离心，保留沉淀并干燥。将干燥的酵母沉淀用适量的提取液处理，离心后收集上清液。 2️⃣ RNA的鉴定水解反应：将提取的RNA进行水解，生成磷酸、核糖和嘌呤碱基。磷酸的检测：通过与特定的试剂反应，磷酸会生成蓝色的还原产物。核糖的显色反应：核糖与特定的试剂反应，生成鲜味的颜色变化。嘌呤碱基的检测：嘌呤碱基与特定的试剂反应，生成白色沉淀。 𐟓Š 实验记录 𐟔𕠧㷩…𘯼š液相为铜蓝色 𐟔𕠦 𘧳–：溶液变为鲜味色 𐟔𕠥˜Œ呤碱基：产生白色架状沉淀 𐟓 实验总结通过本实验，我们成功提取了酵母中的RNA，并对其进行了组分鉴定。实验结果表明，RNA的提取和鉴定是生物化学实验中的重要步骤，对于了解酵母的分子结构和功能具有重要意义。 𐟓 实验注意事项在加热酵母时，应时常振荡试管，使其均匀受热。使用离心机时，确保各试管内反应体含量大致相同。 𐟓 实验评价优点：提取方法简单，提取的RNA质量较高。缺点：提取过程中可能会破坏RNA的完整性。 𐟓 实验改进建议改进提取方法，减少对RNA完整性的破坏。优化鉴定步骤，提高实验的准确性和可靠性。

如何优化PCR实验，减少非特异性条带？在进行PCR实验时，非特异性条带常常让人头疼。今天我们来探讨一下导致非特异性条带的原因，以及如何通过调整实验条件来减少它们。程序方面：退火温度过低：当退火温度过低时，引物与模板之间的碱基配对变得更加容易，即使引物与模板之间的匹配程度不高，也能形成稳定的双链结构。这会导致一些引物与模板之间非特异性结合，从而引发非特异性扩增。提高退火温度可以降低非特异性条带的产生，减少非特异性扩增的发生，提高PCR反应的特异性。 PCR产物过多：在PCR过程中，当扩增产物积累到一定量时，这些产物可能会作为非特异性模板参与到后续的扩增循环中。若程序设置不当导致产物过多，引物与模板之间的非特异性结合位点也可能相应增加。此时通过适当降低循环数、适当缩短延伸时间与退火时间等可以降低非特异性扩增的风险。体系方面：引物问题：引物与靶序列存在非特异性互补、引物自身存在互补序列，容易形成发夹结构或二聚体、引物长度过短或过长等原因均可能导致PCR扩增过程中产生非特异性扩增。可通过降低引物浓度进行优化，必要时建议重新设计引物。模板问题：模板污染：如果样本本身存在污染，或者在提取核酸过程中或实验操作过程中导致模板或整个反应体系受到污染，都可能引发非特异性扩增。此时需重新制备模板；模板降解：降解后的DNA片段可能无法产生预期的目的片段，从而引发非特异性扩增。因此，在实验前可以对模板进行跑胶鉴定，观察泳道是否有弥散或小片段，以确保模板的完整性；模板添加量过高：模板量过大会增加引物与非特异性位点结合概率，也可能导致非特异性扩增。建议依据说明书添加量进行模板添加。酶的问题：普通Taq DNA聚合酶在低温下仍具有较弱的活性，这可能导致在PCR过程中的错误引导靶标延伸和引物二聚体的形成，从而引发非特异性扩增；建议使用热启动酶或适当降低酶使用量。通过以上措施，可以有效减少PCR实验中的非特异性条带，提高实验的准确性和可靠性。

高通量测序中的接头：你了解多少？在二代测序中，接头（Adapter）可是个关键角色，它们就像是待测DNA片段和测序芯片之间的桥梁。接头的连接效率直接影响到文库的质量和产量。那么，接头到底是什么呢？什么是接头？简单来说，接头是在建库过程中加在DNA片段两端的核苷酸序列，这样它们就能和测序仪配合进行测序了。接头的本质其实是一段短的碱基序列，主要分为三个部分： P5和P7序列：这些序列能让文库结合，并在Flow Cell上生成簇。 Rd1 SP和Rd2 SP：这些是启动测序的测序引物结合位点。 Index 1和Index 2：这些序列用于区分样本，允许单次测序或单个Flow Cell通道中混合多个样本。接头的重要性接头的连接效率可是个大问题。如果接头连接不好，那就会导致测序数据的质量下降，甚至可能无法得到有效的数据。所以，优化接头的设计和使用方法，对提高测序效率和准确性至关重要。总结总之，接头在高通量测序中扮演着至关重要的角色。它们不仅是连接DNA片段和测序芯片的桥梁，还是保证测序数据质量的关键。希望这篇文章能让你对接头有个更清晰的认识！𐟓š𐟔쀀

AIRNA：9000万美元A轮融资助力RNA编辑药物研发 AIRNA，一家专注于RNA编辑疗法的生物科技公司，近日宣布完成了超额认购的6000万美元融资，使得A轮融资总额达到了9000万美元。本轮融资由Forbion领投，Ono Venture Investment、Alexandria Venture Investments等新投资者，以及ARCH Venture Partners、ND Capital等老股东共同投资，高榕创投也参与了此轮融资。 RNA编辑是一种前沿的治疗方法，通过修改RNA分子来治疗疾病。与传统的小分子药物和抗体疗法不同，RNA编辑直接作用于遗传信息的传递过程，为一些难以用传统方法治疗的疾病提供了新的治疗途径。 AIRNA的RESTORE+™平台是其核心技术，该平台通过优化寡核苷酸序列、化学特性和递送方式，实现精确、高效和安全的RNA编辑。公司利用这一平台开发的药物旨在解决一系列未被满足的治疗需求。 AIRNA的首个临床候选产品针对Alpha-1抗胰蛋白酶缺乏症（AATD），这是一种遗传性疾病，主要影响患者的肺部和肝脏。A轮融资的资金将用于加快这一候选药物进入临床阶段，并扩展公司的管线布局，推动更多RNA编辑药物的研发。 AIRNA总裁兼CEO Kris Elverum表示，A轮融资得到了顶级投资机构的支持，这将帮助公司实现通过RNA碱基编辑改善患者生活的愿景。公司计划在明年将首个候选药物推向临床，并继续推进RNA碱基编辑平台的建设，解锁传统方法无法实现的治疗目标。总结： AIRNA的A轮融资成功，不仅为公司带来了资金支持，也汇聚了一批行业内的顶级投资机构。随着RNA编辑技术的不断进步，AIRNA有望在治疗遗传性疾病方面取得突破，为患者提供新的治疗选择。公司的RESTORE+™平台展现了RNA编辑药物的潜力，未来有望开发出更多best-in-class药物，满足广泛的医疗需求。AIRNA的愿景是通过创新的RNA编辑技术，为全球患者带来更安全、更有效的治疗方案。

第六章杀手来袭当世界各国政要纷纷前往Z国太空城国际会议厅参与人类延续计划的时候，R国的精英间谍广田不仁企图随着各国的与会代表一起混进Z国的太空城国际会议厅。此次前来参与人类延续计划的国家很多，人员嘈杂，为提高会议的安全等级，叶辰命令太空城总指挥中心开启最高级别的人员身份检测，只有通过身份检测的人，才有资格进入会议厅，目的就是为了肃清那些居心叵测前来破坏这次会议的人。这次检测采用的是最先进的基因检测（也就是基因碱基对对比测试，每个人基因携带的信息不同，这个无法复刻），指纹识别，人脸识别，虹膜识别的检测方式早已被淘汰，无法应对那些蓄意伪装而进行人体改造变脸的伎俩。果然，广田不仁见此情形，不敢贸然闯入。于是他暗中致电R国和M国此次密谋的高层，详细汇报自己掌握的信息。他说：“尊敬的阁下，这次会议的安保措施远比我们想象的还要严格，不能轻举妄动，而且我查看了会议厅周边的布防，全是Z国的王牌战队（曾经叱咤风云令敌国闻风丧胆的特种作战部队，番号战狼，每个成员都有以一当十的本事），他们都配备了Z国最新研发的武器AK3600（根据对敌需要能切换不同的子弹，有常规子弹，麻醉弹，激光等），想要混进去还得另外想办法。” 在听完广田不仁的汇报后，M国和R国的此次密谋行动负责人立即发起了代号为“猎鹰”的刺杀任务，因为时间不等人，他们的行动必须在全世界人民联合起来之前执行。时间来到11月9日，天气阴暗，氛围很诡异紧张，仿佛有大事要发生。这一天只有M国和R国的代表没有到达Z国太空城，他们是人类延续计划的极力反对者。上午九点，叶辰在保镖的拥护下走进会议厅，在全场万众瞩目下，叶辰开始发言了。他说：“来自全球各国的与会代表们，你们好！感谢大家在此地球危机时刻，能够迅速的团结到一起，签署人类延续计划。大家为全人类做的贡献，将流传千古。我宣布：人类延续计划正式启动。我们已经在土星附近轨道部署了太空舰队，做好了两日后开启虫洞的准备，请签署了人类延续计划的国家立即动员起来，做好人员向土星附近轨道转移的准备。还有两天的时间，希望大家效率高一点，一个也不能少！” 话音刚落，全场响起了热烈的掌声。会议持续了三个小时，一片祥和的光景下隐藏着杀气。叶辰的私人保镖安国似乎察觉到了哪里不对劲，以他以往的经验判断，这可能就是暴风雨要来临的前夕。当会议结束后，叶辰走出大厅，并没有察觉到任何异常，一切都有条不紊地进行着。安国紧跟在叶辰身边，不敢有一丝的懈怠，殊不知危险已经一步步在逼近叶辰。 M国派出的杀手爱丽丝已经到达Z国太空城，她此次的任务就是吸引叶辰身边保镖的注意力，制造事端，调虎离山，给宫本武藏刺杀叶辰提供机会。只见她穿着性感的牛仔衣，金发碧眼，化着浓浓的口红，牛仔外套里别着两把等离子手枪，她快速穿梭在来来往往的人群中，等候在叶辰回自己别墅的必经之路上，等待着一个机会。叶辰这时候电话响起了，是黎婷打来的。 “叶辰，会议结束了吧？一切可还顺利？”黎婷问道。 “对，一切顺利。”叶辰回答说。 “切不可掉以轻心哦，可是有很多双眼睛在盯着你呢！”黎婷关切地说道。 “好，我会注意的，谢谢！”叶辰说。此时他的心里乐开了花，因为有黎婷的关心，他对黎婷有一种难以言表的情愫，自从第一次见面开始。 “晚点我过去找你，切记一定要保护好自己！”黎婷接着说。 “嗯，好！”叶辰说完把电话挂了。就在这时，一个身影快速闪过，速度极快，快到看不清楚身形。爱丽丝是克隆改造人，她的体能早已超出了人类极限，并且优化了骨骼，奔跑速度可达20米每秒。她拿出等离子手枪疯狂扫射，制造恐慌，很多路上的行人应声倒地。这时保镖安国意识到了问题的严重性，他立刻对其余保镖下达指令：提高警惕，保护好叶辰！并安排了一个保镖跟随自己前去追击凶手，此刻他只有一个想法，务必要尽快找到凶手，排除隐患。而他只是一个普通人类，尽管体能经过强化锻炼优于常人，但在克隆改造人面前，完全不够看，追了半天被甩出几条街，这时他才意识到大事不妙，自己中计了，便匆忙往回赶。叶辰这边果然出事了，他被R国派出的杀手宫本武藏刺杀了！！！

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